Действие происходит во Фракии (акты первый, второй и пятый) и царстве Аида (акты третий и четвёртый) в мифологическое время. Инструментальная токката предшествует выходу Музыки, которая исполняет вводную часть. Приветствуя аудиторию, она объявляет, что через сладкие звуки может «успокоить любое растревоженное сердце». Она славит свою власть и представляет главного героя драмы, Орфея, который «укрощал диких животных своим пением».

Акт первый

Орфей и Эвридика выходят вместе с нимфами и пастухами, которые выступают в роли греческого хора, комментируя действие. Один из пастухов объявляет, что сегодня свадьба Орфея и Эвридики; хор отвечает, сначала величественно (Vieni, Imeneo, deh vieni…), а потом — в радостном танце (Lasciate i monti…). Орфей и Эвридика поют о своей любви друг к другу, прежде, чем направиться с гостями на свадебную церемонию в храме. Оставшаяся на сцене часть хора повествует о том, как Орфей был преображён любовью, тот, «для кого вздохи были едой, и плач был напитком», превратился в счастливого человека.

Акт второй

Орфей возвращается с главным хором и славит вместе с ним красоту природы. Орфей размышляет о своём прежнем несчастье, но объявляет: «После горя каждый — более удовлетворён, после того, как причиняют боль, каждый более счастлив». Внезапно входит Посланница с вестью, что, собирая цветы, Эвридика получила смертельный укус змеи. Хор сочувственно поёт: «Ах, горький случай, ах, нечестивая и жестокая судьба!», а Посланница наказывает себя за то, что приносит плохие новости («Навсегда я уйду и в одинокой пещере буду вести жизнь в соответствии с моим горем»). Орфей после арии («Ты мертва, моя жизнь, и я дышу?») объявляет своё намерение спуститься в подземный мир и убедить его правителя позволить Эвридике вернуться к жизни, иначе он сам останется там. Орфей уходит, и хор возобновляет свой плач.

Акт третий

Орфей направляется с Надеждой к воротам Подземного мира. Указав на надпись на воротах («Оставьте надежду, все Вы, кто вступает сюда»), Надежда с ним расстаётся. Орфей встречается с перевозчиком Хароном, который отказывается переправить его через Стикс. Орфей пытается убедить Харона и исполняет лестную для него песню (Possente spirto e formidabil nume), но перевозчик неумолим. Однако, когда Орфей начинает играть на своей лире, Харон засыпает. Орфей забирает лодку и пересекает реку, чтобы войти в Подземный мир, в то время как хор духов поёт о том, что природа не имеет защиты от человека: «Он приручил море с помощью хрупкого дерева и презрел гнев ветров».

Акт четвёртый

В Подземном мире Прозерпина, жена Плутона, глубоко тронутая пением Орфея, просит своего мужа выпустить Эвридику. Плутон соглашается, но ставит Орфею условие: всё время, пока он будет вести Эвридику в мир живых, он не должен оглядываться назад, иначе потеряет жену. Орфей выходит из царства мёртвых, увлекая за собой Эвридику. Он предвкушает своё счастье, но с течением времени его начинают одолевать сомнения: «Кто убедит меня, что она следует за мной?» Возможно, Плутон из зависти обманул его? Орфей оглядывается, Эвридика в отчаянии поёт (Ahi, vista troppo dolce e troppo amara!) и исчезает. Орфей пытается следовать за ней, но его удерживает невидимая сила. Хор духов поёт о том, что Орфей, одолев Подземный мир, был, в свою очередь, побеждён своими страстями.

Акт пятый

Возвратившись в родную Фракию, Орфей в длинном монологе оплакивает свою потерю, воспевает красоту Эвридики и решает, что его сердце никогда больше не поразит стрела Купидона. Эхо за кулисами повторяет его заключительные фразы. Внезапно из облаков с небес спускается Аполлон и отчитывает Орфея: «Зачем ты истощаешь свой дар на гнев и печаль?» Он приглашает Орфея оставить мир и присоединиться к нему на небесах, где тот увидит образ Эвридики в звёздах. Орфей отвечает, что было бы недостойно не следовать совету такого мудрого отца, и вместе они поднимаются вверх. Хор пастухов заключает, что «тот, кто сеет в страдании, должен пожинать плоды благодати». Опера завершается энергичным танцем мореска.

Оригинальное завершение либретто

В либретто Стриджо 1607 года монолог Орфея в пятом акте прерывается не появлением Аполлона, а хором разъярённых пьяных женщин, вакханок, поющих о «божественной ярости» их покровителя, бога Вакха. Орфей, отрекаясь от женщин, вызывает их гнев. Чем дольше он избегает их, тем более тяжёлая доля ожидает его. Судьба Орфея остаётся неясной: он покидает сцену, а вакханки в финале оперы поют и танцуют, прославляя бога виноделия.